Забор материала для выявления бледной трепонемы навык

Бледная трепонема (Treponema pallidum) — возбудитель сифилиса: микробиология, антигенные свойства, иммунитет, общая информация о диагностике сифилиса

Мир микроорганизмов чрезвычайно разнообразен и систематизирован учёными-исследователями. Изучение живого микромира активно велось в прошлом столетии. Однако, многие болезни до конца не изучены и в нынешнем веке.

Так, например, до сих пор не существует единого мнения по поводу происхождения сифилиса. Эта «французская болезнь», как наиболее древнее инфекционное заболевание человечества, по утверждению М. В. Милича, возникла на Земле одновременно с появлением человека.

К слову, М.В. Милич — ведущий сифилидолог страны периода 60-80-х годов, автора многочисленных книг и монографий, посвященных сифилису.

Официально открытие возбудителя сифилиса относится к 1905 году. Немецкие микробиологи Ф. Шаудин и Э. Гофман определили ряд морфологических, культуральных, биохимических свойств бледной трепонемы, а также некоторые особенности данного микроорганизма, положенные в основу таксономии.

В данной статье подробно разберем особенности строения, антигенную структуру, биохимические и физиологические свойства инфекционного агента, вызывающего сифилис.

Итак, единственным возбудителем сифилиса человека является Treponema pallidum (бледная трепонема). Она относится к порядку Spirochaetales типа Spirochaetes.

1. Морфология Treponema pallidum

Клетки бледных трепонем имеют длину 6-15 мкм, ширину 0,1-0,2 мкм, представляют собой протоплазматический цилиндр (цитоплазма, окружённая цитоплазматической мембраной), скрученный в спираль. Иногда клетка микроорганизма напоминает штопорообразную тонкую нить.

Рисунок 1 — Строение бледной трепонемы. OM, наружная мембрана; Ef (эндофлагелла или периплазматические жгутики); LP 1, 2, липопротеины; Pg — пептидогликан; CM — цитоплазматическая мембрана. (Из Cox DL, Chang P, McDowall AW и Radolf JD: Наружная мембрана, а не оболочка белков хозяина, ограничивает антигенность вирулентной трепонемы паллидум. Infect Immun 60: 1076)

Число завитков — от 8 до 14 штук. Завитки, одинаковые по размерам, сохраняются при любых движениях клетки, даже при движении трепонемы вдоль или между других клеток, например, форменных элементов крови.

Рисунок 2 — Электронная микрофотография Treponema pallidum. (From Fitzgerald TJ, Cleveland P, Johnson RC et al: Сканирующая электронная микроскопия Treponema pallidum (штамм Nichols), прикрепленная к культивируемым клеткам млекопитающих. J Bacteriol 130: 1333, 1977.)

С полюсов клетки, между оболочкой и цитоплазмой располагаются фибриллы. Одна часть фибриллы зафиксирована, вторая часть остаётся свободной. Фибриллы образуют двигательный аппарат трепонемы паллидум, позволяющий осуществлять несколько типов движения в жидкой среде:

1. 1 Перемещение.
2. 2 Вращение вдоль оси.
3. 3 Сгибание.

Treponema pallidum является грамотрицательным микроорганизмом. Однако, по Грамму не окрашивается, так как имеет в своём составе гидрофобные частицы, не восприимчивые к анилиновым красителям.

При окраске по Романовскому-Гимзе приобретает слабо – розовый цвет. Эта особенность послужила основанием для видового названия возбудителя сифилиса.

Treponema pallidum subsp pallidum — это требовательный к условиям окружающей среды микроорганизм, который имеет узкие оптимальные диапазоны pH (7,2-7,4), Eh (-230-240 мВ) и температуру (30-37°C). Трепонемы быстро инактивируются слабым теплом, холодом, высушиванием и большинством дезинфицирующих средств.

Традиционно трепонемы паллидум считались строгими анаэробами, но теперь они известны как микроаэрофильные бактерии.

2. Культуральные и биохимические свойства

Treponema pallidum, по сути, является облигатным паразитом, поэтому не способна к жизнедеятельности на искусственных питательных средах.

Несмотря на интенсивные усилия в течение последних 75 лет, T pallidum pallidum не были успешно культивированы in vitro. Жизнеспособные микроорганизмы могут сохраняться в течение 18-21 дней в комплексных средах, а ограниченная репликация была получена совместным культивированием с клетками культуры ткани. Другие три патогенных вида трепонем также не были успешно выращены in vitro.

При культивации бледная трепонема теряет свою патогенность, но, тем не менее, сохраняет некоторые антигенные свойства (эту особенность используют для постановки реакции Вассермана).

Культуру, в основном, культивируют в тестикулах кроликов. В ткани тестикул трепонема паллидум размножается, вызывая орхит у многострадальных животных.

Размножается Т. pallidum бинарным поперечным делением при температуре около 37˚С. Время генерации in vivo относительно велико (30 часов).

Трепонемы малоустойчивы во внешней среде.

1. 1 Вне человеческого организма живут несколько минут, после высыхания погибают. Так, при температуре 40˚С трепонемы погибают в течение нескольких часов, при температуре свыше 50˚С — в течение 15 минут.
2. 2 При неблагоприятных условиях микроорганизм образует L–формы, а также цисты, которые, в свою очередь, способны, к образованию вновь спиралевидных форм.

По типу метаболизма Т. pallidum является хемоорганогетеротрофом. Это означает, что в качестве источника энергии для жизнедеятельности бледная трепонема использует органические вещества и энергию химических связей.

Ввиду неспособности к существованию Т. pallidum in vitro биохимические свойства изучены не достаточно хорошо.

3. Антигенная структура

Т. pallidum имеет мало изученную антигенную структуру. Она представлена специфическим термолабильным протеиновым антигеном, неспецифическим липоидным антигеном, а также антигеном полисахаридной природы.

Проще говоря, антигены бледной трепонемы – это преимущественно белки, липиды и полисахариды наружной мембраны клетки.

Важную роль играет липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактерии. Он выполняет антигенную и токсическую функции, являясь эндотоксином бледной трепонемы.

Липоидный антиген сходен с тканевым экстрактом бычьего сердца – кардиолипином.

4. Факторы патогенности

Как и биохимические свойства, факторы патогенности трепонем изучены не достаточно хорошо.

После попадания в макроорганизм Т. pallidum высвобождает специфические белки, липополипротеины и липополисахариды, проявляющие токсические свойства после ее гибели.

Липополипротеины участвуют в активации иммунной системы, а протеины сходны по отдельным свойствам с бактериальными гемолизинами.

К факторам патогенности бледной трепонемы относят способность высвобождать эндотоксины и липидные антигены по все видимости, из липидов митохондриальных мембран, обладающие свойством аутоантигенов.

Т. pallidum, являясь грамотрицательной бактерией, не продуцирует экзотоксины, однако обладает токсической активностью в отношении некоторых клеток, например, нейробластов.

5. Виды иммунитета

В ответ на внедрение возбудителя сифилиса в организм человека возникает клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Клеточный иммунитет связан с фиксацией бледной трепонемы к клеткам органов и тканей и последующей активацией макрофагов, Т-лимфоцитов. При этом из организма человека возбудитель сифилиса не элиминируется.

Гуморальный иммунитет характеризуется образованием специфических иммуноглобулинов. На ранних этапах инфекции в организме человека образуются IgM. По мере прогрессирования инфекции активируется синтез IgG. IgA синтезируется в малых количествах. Вопросы участия и синтеза IgD и IgE не достаточно хорошо изучены.

6. Чувствительность к антибактериальным препаратам

Возбудитель сифилиса чувствителен практически ко всем антибиотикам, но к препаратам выбора относятся пенициллины.

В основе клеточной стенки бледной трепонемы лежит пептидогликан, выполняющий защитную функцию. Этот пептидогликан является «мишенью» для основного антибактериального препарата, предназначенного для лечения сифилиса – пенициллина. Антибиотики группы пенициллинов разрывают тетрапептидные связи пептидогликана.

При воздействии антибиотика на растущую бледную трепонему (возможно, при длительном воздействии) образуется L-форма бактерии. Такая форма лишена клеточной стенки, но всё ещё способна к размножению.

Определение чувствительности бледной трепонемы к антибактериальным препаратам не проводится.

7. Лабораторная диагностика сифилиса

Лабораторные методы диагностики сифилиса условно можно разделить на 2 группы:

1. 1 Выявление самого возбудителя заболевания из биологических препаратов (содержимое шанкра, гнойное отделяемое папул, пунктаты из лимфатических узлов).
2. 2 Серологические реакции.

Серологические реакции используются как для верификации диагноза, так и для оценки эффективности терапии сифилиса. Особенность серологии сифилиса сводится к отсутствию положительных результатов анализов на раннем этапе заболевания.

Объясняется это достаточно просто. Так, инкубационный период сифилиса в среднем составляет 3-5 недель. Было замечено, что у асоциальных лиц, злоупотребляющих спиртным, а также у лиц с туберкулёзом и ВИЧ-инфекцией инкубационный период отличается от средних показателей в сторону уменьшения ( 2 недели).

Инкубационный период увеличивается на фоне приёма различных антибактериальных препаратов (до 6 месяцев).

На протяжении этого времени концентрация антител не успевает достигнуть диагностического титра. Однако, у инфицированного человека могут присутствовать клинические симптомы. Такой сифилис называется серонегативным.

Серопозитивным называют сифилис с яркой клинической картиной и присутствием в крови диагностического титра антитела (то есть положительный результат серологических реакций). При отсутствии лечения серопозитивный сифилис перетекает во вторичный сифилис, длящийся несколько лет.

8. Выявление T. pallidum в субстрате

8.1. Методика исследования Т. pallidum в «тёмном поле»

Популярным методом диагностики является обнаружение бледной трепонемы в тёмном поле микроскопа. Этот метод позволяет наблюдать за трепонемой, учитывать особенности её морфологии и движения.

Материал для исследования забирают с твердого шанкра или с эрозий гранулём и папул. Осторожно захватывают предварительно очищенный материал петлей, смешивают с каплей физиологического раствора и наносят на предметное стекло.

Живой материал изучают в тёмном поле микроскопа. Для этого применяют специальный конденсор, позволяющий изучать трепонему «во всей красе».

8.2. Микроскопия мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе

Для исследования фиксированных (сухих) мазков используется метод окрашивания по Романовскому-Гимзе. При таком окрашивании другие виды трепонем приобретают фиолетовый оттенок, а Т. pallidum — бледно-розовый цвет.

Остальные методы исследования, такие как способ Бури, серебрение по Морозову, простой фуксиновый метод и др., не получили широкого практического применения, ввиду малой информативности.

9. Серодиагностика

Выявление антител к бледной трепонеме проводится для:

1. 1 Подтверждения клинического диагноза сифилиса;
2. 2 Установления диагноза скрытого сифилиса;
3. 3 Контроля за эффективностью проводимого лечения;
4. 4 Подтверждения выздоровления больных сифилисом;
5. 5 Профилактика сифилиса и диспансеризация населения (исследование крови определённых категорий людей, например, относящихся к группам риска).

Современные методы серодиагностики основаны на выявлении специфических и неспецифических антител разных классов.

9.1. Неспецифические серологические реакции

Лабораторное исследование крови проводится на предмет обнаружения противолипидных антител.

• Реакция Вассермана (РВ, RW)

Является классической неспецифической реакцией. В её основе лежит принцип связывания комплемента. Проводится реакция с двумя-тремя антигенами. Исполняется как для количественного, так и для качественного определения неспецифических антител.

RW ставится с кардиолипиновым и трепонемным антигеном. Последний позволяет повысить специфичность реакции и оценить состояние иммунитета больного.

При первичном сифилисе RW имеет положительное значение в конце инкубационного периода, т.е. через примерно 4 недели от начала заболевания.

При исследовании больных вторичным сифилисом положительная RW выявляется у 100% больных и у 75% больных в стадии третичного сифилиса.

Нередко, RW даёт ложноположительные результаты. Они имеют место быть при следующих физиологических состояниях:

1. 1 При других инфекциях, вызванных вирусами, бактериями, простейшими;
2. 2 При злокачественных опухолевых процессах;
3. 3 При коллагенозах;
4. 4 При беременности на поздних сроках (после 30 недели) и после родов;
5. 5 У здоровых лиц, употребляющих спиртные напитки, а также после приёма жирной пищи.

• Реакции, основанные на агглютинации кардиолипина (MP — RPR, VDRL)

Эти реакции являются методом экспресс-диагностики сифилиса. По своему существу, это микрореакции, проводимые с плазмой крови (наиболее чувствительный метод) и инактивированной сывороткой (второй по чувствительности).

Они проводятся капельным способом и требуют использование специального антигена. Этот метод серодиагностики проводится для отбора положительных проб с дальнейшим исследованием лиц с помощью специфических реакций.

9.2. Специфическая серодиагностика

В основе диагностики представлены различные методы обнаружения специфических антител.

9.2.1. Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)

Занимает срединное положение из всех специфических методов серодиагностики. Реакция основана на принципах идентификации методом люминесцентной микроскопии флюоресцирующего комплекса, связанного с иммуноглобулином организма человека на поверхности клетки-патогена.

Флюоресцирующий комплекс состоит из человеческого глобулина и флюоресцеин тиоизоционата. Существует несколько модификаций этой реакции:

1. 1 Реакция иммунофлюоресценции с адсорбцией;
2. 2 Реакция IgМ – РИФ с адсорбцией.

9.2.2. Реакция иммобилизации Treponema pallidum (РИБТ)

Реакция РИБТ основана на особенности заражённой сыворотки крови людей обездвиживать бледные трепонемы.

В общих чертах методику можно объяснить так: в кровь больного добавляют антиген, приготовленный из сифиломы кролика и комплемент.

Иммобилизирующие антитела — это поздние антитела. Своего максимума они достигают к концу первого года болезни. Этот метод не применяется при первичном серонегативном сифилисе, считается наиболее трудоёмким.

9.2.3. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)

Данный метод диагностики автоматизирован. По чувствительности и специфичности сходен с реакцией иммунофлюоресценции с адсорбцией.

9.2.4. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

На фоне других серологических исследований, РНГА отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, особенно при использовании высококачественного антигена.

Принцип реакции основан на агглютинации эритроцитов, несущих на своей поверхности антигены бледной трепонемы, если к ним добавить специфические антитела. Результат РПГА будет положительным уже в конце инкубационного периода, т. е. через 3-4 недели.

Учитывая все особенности возбудителя сифилиса, можно выделить мероприятия, направленные на защиту здорового человека от заражения сифилисом.

Так как заболевание передаётся половым и контактным (бытовой сифилис) путями, стоит знать, что эффективными способами защиты являются барьерная контрацепция и соблюдение общих правил гигиены.

Источник